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酵母转化(陈晗俊)...doc

酵母转变 规律: 咱们应用的是PEG LiAc法改革酵母。 聚氧乙烯是一种高分子高分子化合物,独自的式量高达3000 PEG将研制最大的转变和升降机功能。。本文旧的的聚氧乙烯式量为3350。 ,试验成功实现的事指示,转变能力可达1。 cfu/μg 。聚氧乙烯在酵母转变中起注意要的保卫覆盖的功能,蒸发醋酸锂对覆盖结构的过渡伤害,助长质体与覆盖的密集地尝。聚氧乙烯的浓度不可避免的胜任。,这很重要。。 LIAC能使酵母细胞发生瞬变现象的欢迎国家。,此刻,它们可以绘画外源DNA。 。 鲑鱼睾丸DNA 短线性的单链DNA ,在转变试验中,质体从DNA中被保卫。 除此之外,在酵母细胞中也可获得外源性环质体DNA。 研制辅佐功能。一定要在每回应用前举行热变性。,可合的的双链DNA 翻开,使安全鲑鱼睾丸DNA 转变试验零碎中单链方式的在性 推论的、装备仪器及药剂: SD 底层: YNB: 1.6 g/L 硫酸铵:5g/L 氨基酸:本质体滤除的专一性压力选择 监控pH 5.8,121°使不起作用15min YPDA底层 胰蛋白胨 20g/L 酵母抽出物10g/L 洋菜 20g/L 固体的 腺咖啡碱 15ml 0.2% 腺咖啡碱/ L 监控pH 7.5,121°使不起作用15min 0.9%NaCl(w/v) NaCl: 0.9g milipore水 100mL的集中:稳定地集中或指向:目录 使不起作用121度,20min 100%DMSO 从药剂瓶到EP管,每管500升,室温保持原状 10×TE(pH值 7.5): (0.1M Tris-HCl,10mM 乙二胺四醋酸) Tris-HCl 1.211g/100ml EDTA 0.37g/100ml 监控pH 7.5, 121°,20min 10×LiAc(pH值 7.5) 1M LiAc 10.202g/100ml 用醋酸监控pH值 7.5,121°使不起作用20min 1.1×TE/LiAc Tris-HCl 11ml 10×LiAc(pH值 7.5)/100ml EDTA 11ml 10×EDTA (pH值 7.5)/100ml 监控pH 7.5, 121°,20min 50% PEG3350: PEG3350: 50g 使不起作用玉米色水: 100m集中:稳定地集中或指向:目录 (50度水浴辅佐烈性酒),聚氧乙烯招待吸收。,非使不起作用 PEG/LiAc:现配现用,极好的建立工作关系切中要害手柄,将母液绘画至EP管或50mL离心管 终浓度10ml PEG3350 40% 8ml 50%PEG3350 TE buffer 1× 1ml 10×TE LiAc 1× 1ml 10×LiAc 变性鲑鱼DNA 10mg/ml milipore水,70%普通酒精棉球,4 50mL离心分离机管,一盒EP管,15ML试管架,50ml试管架,EP管架 详细方式: A:酵母相当的资产的预备工作 从任何人完全地或保种管,摘点酵母,McAb在YPDA板上,30度培育3天摆布。 从平直地上取出直径为2-3mm的单克隆抗体,以3mL。 YPDA玻璃电子管(一致3管) 30°,250rpm,培育8-12h 取200ul 菌液,OD600的测 选择具有最大OD600值(难以完成的有生气的)的试管,绘画5ul转变至50m陌生地的YPDA底层中(底层装在250ml三角瓶中) 30°,230rpm,培育16-20h,直至OD600 0.15-0.3 培育菌转变到2 50mL离心管切中要害背诵,室温离心分离机3000 0g,3min,弃上清液液液液液,用100ml鲜YPDA挂在管底的细菌,倒进任何人洁净的瓶子。 30°,230rpm培育直到OD600 0.4-0.5(3-5小时) 将细菌倒入2个50ml离心管中,室温离心,3000g,3min,弃上清液液液液液,每个离心管30ml 微孔水重挂液。 再离心分离机,3000g,3min,弃上清液液液液液,每个管道为1.4ML 1.1×TE/LiAc重悬。 将挂液转变到2根EP管上,12000rpm,15s 弃上清液液液液液,每个管道都是600升。 1.1×TE/LiAc重悬,两个再挂管合在任何人管中。,预备革新。 B:酵母质体转变 小程度大程度替换 分支机构质体DNA 100-500ng 3-5ug 鲑鱼精DNA 变性的,10mg/ml 5ul 20ul 觉得细胞, 轻易被说服的混合 50UL 600ul 分支机构PEG/LiAc, 轻易被说服的混合 500ul 2.5ml 30度水浴,每10-15min轻易被说服的混合 30min 45min 分支机构DMSO, 轻易被说服的混合 20ul 160ul 42度水浴,每5-10min轻易被说服的混合 15min 20min 离心,弃上清液液液液液 最大昌盛 3000g 15s 3min 副手分量的气体YPDA

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